Kĩ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), như tên gọi của nó, là kĩ thuật giúp phân biệt 2 trình tự DNA nhờ vào sự khác biệt về độ dài của các đoạn DNA do một hay nhiều enzyme cắt giới hạn cắt ra từ trình tự DNA ban đầu. (đây là định nghĩa theo cách hiểu của tôi chứ không phải định nghĩa trong giáo khoa nhé).

Nếu ta có một đoạn DNA, dài 1kb chẳng hạn, trong đoạn này có một vị trí cắt của enzyme EcoRI đã biết trước. Khi dùng RFLP với enzyme EcoRI, đoạn DNA sẽ bị cắt thành 2 đoạn nhỏ hơn với kích thước xác định mà ta có thể dự đoán được. Một đoạn DNA khác, cũng dài 1kb, có trình tự tương tự, nhưng ở vị trí cắt của EcoRI thì có một đột biến thay thế chẳng hạn, đột biến này làm EcoRI không còn nhận biết vị trí cắt đó nữa, khi đó đoạn DNA sẽ không bị cắt với EcoRI. Dựa vào độ dài của sản phẩm sau khi cắt, ta có thể phân biệt được hai trình tự DNA như trên.

Trước đây, để phát hiện sự khác biệt về độ dài của các đoạn cắt giới hạn này, người ta sẽ chạy điện di, lai Southern Blot với mẫu dò đánh dấu phóng xạ rồi làm phóng xạ tự chụp. Bây giờ, với sự phát triển của kỹ thuật PCR, người ta có thể nhân bản đoạn DNA mục tiêu lên nhiều lần, đem cắt và có thể phát biện trực tiếp bằng điện di trên gel agarose.

về ứng dụng thì có thể ứng dụng kĩ thuật này trong phân loại phân tử, trong chẩn đoán một số bệnh di truyền (như bệnh hồng cầu hình liềm là vd kinh điển về pp RFLP trong chẩn đoán bệnh), để phát hiện các đột biến....

Everything has two sides or more.

Gửi lúc 15:40, 22/09/03

Tùy trường hợp ứng dụng bạn ạ, đôi khi không cần phải biết trước trình tự DNA đâu. Ví dụ bạn dùng RFLP để làm DNA fingerprinting (lấy dấu tay DNA) trong pháp y, thì chỉ cần dựa vào số vạch (chẳng hạn) là phân biệt được các cá thể rồi cần gì biết trình tự DNA làm gì?

Dĩ nhiên trong một số trường hợp việc biết trình tự là cần thiết, trình tự có thể lấy được từ ngân hàng gene, thể giải trình tự bằng máy ..., thường thì khi muốn thử xài RFLP, tôi sẽ lên mạng load trình tự của gene quan tâm về, dùng phần mềm coi coi trong đoạn đó có những vị trí cắt của những enzyme nào, sau đó mới chọn enzyme, rồi làm...hay coi trong các bài báo coi có ai làm cách này chưa, có rồi thì làm theo coi được hông? :)

Southern Blot là phương pháp lai để phát hiện ra DNA trên màng lai bằng mẫu dò DNA có đánh dấu. Mẫu dò là một đoạn oligonucleotide ngắn, có thể đánh dấu phóng xạ (bây giờ ít dùng) hay đánh dấu một số chất phát huỳnh quang khác. Có thể tóm gọn trình tự làm như sau: các đoạn DNA được diện di trên gel agarose, sau đó được chuyển qua màng nitrocellulose (cách chuyển này giữ nguyên vẹn vị trí các đoạn DNA trên gel). DNA được biến tính tách mạch, cố định trên màng lai, rồi cho mẫu dò vào, mẫu dò sẽ bắt với trình tự bổ sung với nó trên DNA, các mẫu dò không bắt cặp được sẽ bị rửa trôi trong bước rửa, tiếp sau đó là bước phát hiện những vạch DNA nào có mẫu dò bám vào bằng phóng xạ tự chụp (nếu đánh dấu mẫu dò bằng phóng xạ) hay bằng các cách khác thích hợp cho từng chất đánh dấu.

Northern blot cũng tương tự nhưng dùng cho RNA, western blot là dùng cho lai protein-protein.

bạn đọc thêm cuốn Di truyền học- Phạm Thành Hổ, hay Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương đều có nói khá rõ và dễ hiểu về các vấn đề này.

Everything has two sides or more.

Gửi lúc 15:47, 25/09/03